一、實驗原理

細胞克隆形成實驗是用來檢測細胞增殖能力、侵襲性、對殺傷因素敏感性等項目的重要技術方法。當單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，成為集落或克隆。其中細胞克隆形成率即細胞接種存活率，表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量。

（貼壁后的細胞不一定每個都能增殖以及形成克隆，而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。）

二、克隆形成的目的

1）通過對細胞處理后在細胞培養板上的克隆形成能力來提示處理后細胞的增殖能力。

2）評價不同殺傷因素(藥物、基因等)對腫瘤細胞增殖能力或群體依賴性的敏感性;

3）評價細胞在體內成瘤性，癌細胞不一定都可以在體內成瘤，但若體外克隆能力越強，即表明體內成瘤性越強，算是一種模擬體內成瘤的體外實驗。

三、克隆形成的分類

克隆形成依據采用的培養介質的不同，分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類。

1. 平板克隆：細胞培養在培養基中，應用于貼壁的細胞。

2. 軟瓊脂克隆：細胞被瓊脂糖掛起來，主要應用于懸浮的腫瘤細胞和轉化細胞系。

四、兩種實驗技術的具體操作

1.平板克隆實驗過程：

所需材料：基礎培養基（根據細胞選擇適用種類）、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、青霉素-鏈霉素溶液（100X）、多聚甲醛固定、結晶紫染液、Giemsa染液

實驗步驟：

1）6孔板

①將處于對數生長期的細胞胰酶消化后，完-全培養基（基礎培養基+10%胎牛血清）重懸成細胞懸液，并計數；

②細胞接種：于6孔板培養板中各實驗組接種400-1,000個細胞/孔（根據細胞生長情況確定，一般為700個細胞/孔）;

③繼續培養到14天或絕大多數單個克隆中細胞數大于50為止，中途每隔3天進行換液并觀察細胞狀態；

④克隆完成后，在顯微鏡下對細胞進行拍照，然后PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗滌1次；

⑤每孔加入結晶紫染液1ml，染細胞10-20 min；

⑥PBS 洗滌細胞數次，晾干，數碼相機拍照（分別對整個六孔板及每個孔進行單獨拍照）。

注意事項

1.每隔3天進行換液，在換液時，緩慢加入培養基，避免吹起細胞。

2.染色完成后，務必將染液清洗干凈，不要在孔中有殘留。

2）平皿

①取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在完-全培養基（基礎培養基+10%胎牛血清）中備用。

②將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組5個平行樣。每組細胞每皿分別接種100個細胞于含10ml 37℃預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。

③置37℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養2～3周。

④當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。

⑤加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘。

⑥去固定液，加適量Giemsa應用染色液染10～30分鐘

⑦用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

⑧將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數大于10個細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。

【克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%】

注意事項

1.平板克隆形成實驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。

2.實驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。

3.細胞不能有細胞團，接種密度不能過大。

數據分析

顯微鏡下觀察陽性克隆，即每個克隆>50個細胞，相機拍照，數克隆數（大小約在0.3-1.0 mm）計算克隆形成率，并統計克隆大小。

2.軟瓊脂克隆形成

軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長實驗，利用軟瓊脂為培養介質，使細胞在懸浮狀態下生長。某些惡性腫瘤細胞，不僅在貼壁狀態下能增殖，在懸浮狀態下也能增殖，進而通過軟瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度，可用于細胞分化的基礎研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗等方面。

①配制1.2% 和0.7%瓊脂，高壓滅菌后，維持在42℃中使其不會凝固；

②將1.2% 瓊脂與2×培養基混合，鋪入6孔板作為下層膠，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；

③將制備好的單細胞懸液與0.7%瓊脂充分混勻，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培養基，每3天更換一次；

④根據細胞的生長速度培養2~3周后顯微鏡下觀察克隆大小，與平板克隆一樣，每個克隆>50個細胞，顯微鏡拍照。若拍整個孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍（NBT）染色，37°C過夜，拍照。

數據分析：顯微鏡或相機拍照，計算克隆形成率

注意事項

1.上層軟瓊脂使細胞分散成單個，下層軟瓊脂作為支撐防止細胞貼附生長。最后鋪上一層培養基是為了防止膠干燥，并給細胞補充營養，如果做藥物處理，則在培養基中加入藥物。

2.上層膠細胞數目根據不同的細胞類型而定。一般以5000個細胞/孔作為起始濃度，根據需要調整。

3.瓊脂放入水浴鍋中維持在42℃左右。溫度過低瓊脂凝固，在做基底時瓊脂凝固過快會導致不均一，溫度過高則會將細胞燙死。此外，實驗過程中速度要快，防止局部結塊。

小結：

兩種細胞克隆方式，該如何選擇：

根據實驗對象和目的選擇，平板克隆檢測貼壁腫瘤細胞的增殖能力和致瘤性，軟瓊脂克隆形成實驗除了檢測貼壁細胞，還能檢測懸浮腫瘤細胞和轉化細胞系，具有平板克隆不可取代的優勢。若只是簡單評價貼壁細胞的增殖能力和群體依賴性，則選擇平板克隆即可。