一、關于夾心ELISA

夾心ELISA測定兩層抗體（即捕獲抗體和檢測抗體）間的抗原。靶抗原必須包含至少兩個能夠結合到抗體的抗原位點。單克隆或多克隆抗體均可在夾心ELISA系統中用作捕獲抗體和檢測抗體。單克隆抗體識別單一表位，可對抗原中微小差別進行定量。多克隆抗體通常用作捕獲抗體以沉降盡可能多的抗原。

夾心ELISA去掉了分析前的樣品純化步驟，提高了靈敏度（比直接或間接法靈敏2–5倍）。

二、實驗步驟

1.用捕獲抗體包被

①以捕獲抗體濃度為1-10μg/mL的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6)包被PVC微量滴定板的孔。
②未純化抗體（例如腹水液或抗血清）可能需要增加樣品蛋白質的濃度（嘗試用10μg/mL）補償濃度更低的特異性抗體。
③用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜。
④棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μLPBS。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。?

2.封閉和加樣
①每孔添加 200μL 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS）封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。
②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少1-2小時，或在4℃下孵育過夜。
③用200 μL PBS洗滌微量滴定板兩次。
④將100 μL 稀釋樣品添加到每個孔。通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每板都必須測定標準品（兩重測定或三重測定）和空白樣品。37°C條件下孵育90分鐘。確保標準品濃度涵蓋抗體結合的大部分動態檢測范圍。可能需要優化濃度范圍以獲得合適的標準曲線。通常樣品和標準品采取兩重測定或三重測定。
??⑤移除樣品，用200μL PBS洗滌微量滴定板兩次。

3.用檢測抗體和二抗孵育

①將100μL稀釋的檢測抗體添加到每個孔。?確保檢測抗體識別與捕獲抗體靶蛋白的不同表位。這可防止對抗體結合的干擾。盡可能使用已測試的成對匹配抗體。
②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育2小時。
③用PBS洗滌微量滴定板四次。
④添加100μL偶聯二抗，使用前將其在封閉緩沖液中稀釋。
⑤用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育1-2小時。
⑥用PBS洗滌微量滴定板四次。

三、檢測

考慮到某些生物材料具有高水平內源酶活性（例如肺泡細胞中的高水平ALP、紅細胞中的高水平過氧化物酶），這可能會導致非特異性信號。如有必要，用左旋咪唑（針對ALP）或用0.3% H2O2的甲醇溶液（針對過氧化物酶）進行另外的阻斷處理。

ALP底物

對硝基苯磷酸鹽(pNPP)是大多數應用常用的底物。室溫孵育15–30分鐘后在405 nm處測定硝基苯酚呈現的黃色，并加入等量0.75M NaOH 終止反應。

HRP顯色液

HRP的底物為過氧化氫。過氧化氫的裂解與氫供體的氧化偶聯，反應期間氫供體的氧化使顏色發生變化。

TMB（3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺）

將TMB溶液添加到每個孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液(2M H2SO4)，然后在450nm 處讀取光密度。

某些酶底物被認為是有害的（潛在致癌物），因此應始終小心處理并佩戴手套。

四、數據分析

由系列稀釋液得到的數據繪制標準曲線，濃度標在X軸（對數標度）上，而吸光度標在Y軸（線性標度）上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。